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The Crop Journal | 安徽农大联合安徽省农科院利用多种工程策略提高了水稻Cas12a碱基编辑系统效率

社会万象2023-04-09 10:48

单碱基突变可引起作物许多农艺性状的改变。因此，实现单碱基编辑对作物遗传改良具有重要意义。目前， 大多数植物碱基编辑系统通过以SpCas9 D10A变体为底盘融合脱氨酶发展而来，但拓展不同CRISPR-Cas底盘对于植物碱基编辑系统的重复有效应用有重要意义。Type V亚家族的CRISPR-Cas12a是一类具有重要工程化潜力的底盘系统，目前已广泛用于动植物基因编辑操作中。与Cas9通过RuvC和HNH两个核酸酶结构域产生双链断裂不同，Cas12a缺少HNH结构域，目前还没有发现有效的切刻酶（nickase）变体。因此，植物Cas12a单碱基编辑系统需要充分研究。
近日，安徽农业大学联合安徽省农业科学院在The Crop Journal在线发表了题为“Development of plant cytosine base editors with the Cas12a system”的研究论文。作者利用多种工程策略，提高了水稻中Cas12a碱基编辑的效率。
作者首先将大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1 （rAPO1）和两个尿嘧啶糖基酶抑制剂（UGI）融合到Lachnospiraceae Cas12a D832A变体（dCas12a）的N端和C端，构建了植物Cas12a-BE3载体（图1），在水稻愈伤和转基因植株中测试结果均表明植物Cas12a-BE3的碱基编辑效率较低。为了提高Cas12a-CBE的编辑效率，在Cas12a-BE3中融合了人Rad51d基因的DNA单链结合结构域，发展了Cas12a-hyBE3载体，其C-T编辑效率比Cas12a-BE3高2.66倍。为了测试不同脱氨酶对Cas12a-CBE编辑效率的影响，分别使用胞苷脱氨酶Anc689、evoFERNY、APOBEC3A N57G变体（eA3A）和截短的APOBEC3B（A3Bctd）替换Cas12a-hyBE3中的rAPO1，构建了Cas12a-hyANC，-hyFERNY，-hyeA3A和-hyA3Bctd。在水稻愈伤细胞中，Cas12a-hyA3Bctd的C-T编辑频率最高，是Cas12a-hyBE3的2.86~6.05倍。此外，已有研究表明Cas12a的耐高温D156R突变（ttCas12a）能增加Cas12a的剪切活性。通过引入D156R突变，得到的ttCas12a-hyA3Bctd的C-T编辑效率进一步提高，在6个靶点中， 16.67%~68.75%的水稻转基因植株中含有目标碱基变异，平均编辑效率为42.01%，编辑窗口集中在10~15位。与SpCas9发展的CBE不同，ttCas12a-hyA3Bctd编辑植物中副产物很少。此外，利用同样的效率优化策略所构建的ttCas12a-hyABE8e，在水稻的三个靶标的A-G的编辑效率分别为54.17%、10.42% 和14.58%，也表现出较高的编辑能力。该研究表明利用Cas12a可以实现植物基因组有效碱基编辑，为作物遗传育种提供多种选择。
图1 Cas12a胞嘧啶碱基编辑器结构示意图

作者和基金项目


安徽农业大学农学院硕士研究生王欢欢和梁静为该文共同第一作者，安徽农业大学魏鹏程教授和安徽省农业科学院水稻研究所李娟副研究员为共同通信作者。该研究得到国家自然科学基金项目（U19A2022，32000284）、安徽省自然科学基金项目（2208085Y11，2108085Y07，2008085QC101，2008085MC71）、安徽省高校协同创新计划项目（GXXT-2021-056）等资助。

本文转载自The Crop Journal


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